Química de Productos Naturales: generalidades de cromatografía- UTMACH

Química de Productos Naturales: generalidades sobre las técnicas cromatográ

  1. htrinidad86
    Química de Productos Naturales: generalidades sobre las técnicas cromatográ
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    Química de Productos Naturales: generalidades de cromatografía- UTMACH
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    • 1. CROMATOGRAFÍA Dra. Haydelba D’ Armas, PhD Mayo de 2014
    • 2. 2 TECNICAS SEPARATIVAS Clasificación: Precipitación. líquido - líquido Extracción en fase sólida Destilación Cromatografía
    • 3. 3 CROMATOGRAFÍA Definición: “Es una técnica capaz de separar compuestos en base a diferencias de su afinidad por una fase estacionaria y una móvil”. Sistema Cromatográfico: Fase Móvil Fase Estacionaria Soluto
    • 4. 4 Proceso Cromatográfico (1) Proceso físico - químico que rige la separación: • Adsorción: El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentes de hidrógeno • Partición o Reparto: El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio
    • 5. 5 Proceso Cromatográfico (2) • Intercambio Iónico: Los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones ( resina) • Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel: No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula
    • 6. 6 Fase estacionaria Fase móvil Proceso cromatográfico Capa fina Columna Adsorción I. Iónico Exc. Molecular Columna Adsorción Papel Capa fina Columna Partición Columna Partición Líquida Líquida Sólida Líquida Gas Gas Técnica cromatográfica
    • 7. 7 1. Fundamentos Fig.1 1903: usó columnas de adsorción para separar Tswett (1872-1919) Fase móvil pigmentos vegetales Pigmentos vegetales Fase estacionaria Chroma: color Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA
    • 8. 8 Según la disposición de la fase estacionaria: •Cromatografía plana: Cromatografía en capa fina Cromatografía en papel •Cromatografía en columna: Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases Cromatografía de fluidos supercríticos
    • 9. 9 Fase estacionaria CROMATOGRAFÍA PLANA Papel Cromatografía en papel Adsorbente sobre soporte Cromatografía en capa fina Gel de sílice, poliamida…. Lámina de vidrio, de plástico o metálica METODOLOGÍA DE TRABAJO 1 2 3 4 5 Papel Tapadera Fase móvil
    • 10. Cromatografía en capa fina 11 (CCF) CCF en solventes de distintas polaridades
    • 11. 12
    • 12. 14 La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedad o bajo la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía) x a b Rf  a b a - distancia recorrida por el analito. b - distancia recorrida por el frente
    • 13. •La cromatografía en capa fina es una técnica para determinar el número de componentes de una mezcla y como una prueba preliminar para realizar una cromatografía en columna, entre otros •El proceso de cromatografía en columna se controla por cromatografía en capa fina, de tal manera que se puede separar cada componente de la mezcla •La cromatografía en columna se usa para separar grandes cantidades de material: > 100 mg. El proceso de cromatografía consta de una fase móvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales dependen de las sustancias
    • 14. 16 Fase Móvil -COOH -OH -NH2 -SH -CHO - CO -COOR -OCH3 Hidrocarburos No Saturados Hidrocarburos Saturados Ácidos carboxílicos Alcoholes Aminas Tioles Aldehidos Cetonas Esteres Éteres Alta Baja Polaridad
    • 15. 17 Técnica de Revelado: bañado o pulverización Clasificación de reveladores . H2SO4 I2 Lámpara ultravioleta Destructivo No Destructivo H2SO4 (o con molibdato de amonio o vainilina) Lámpara ultravioleta I2 Ftalato de anilina (azúcares) Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas) Difenilamina + UV 254 (I. Clorados) Generales Selectivo Específico
    • 16. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA EMPAQUETADO COLUMNA LECHO CROMATOGRÁFICO f. estacionaria COLUMNA llave ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES MUESTRA APLICACIÓN MUESTRA RESERVORIO f. móvil FLUJO gravedad DIFUSIÓN SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO
    • 17. Fase móvil Fase estacionaria Muestra (A+B) B A B B A B
    • 18. Según el tipo de fase móvil: •Cromatografía de líquidos (LC) •Cromatografía de gases (GC) •Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) En columna o en superficie plana En columna
    • 19. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio LC Reparto Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre líquidos inmiscibles Adsorción Sólido Adsorción Intercambio iónico Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico Exclusión por tamaños Líquido en intersticios de un sólido polimérico Distribución/Exclusión GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre gas y líquido Gas-sólido Sólido Adsorción SFC Especies orgánicas enlazadas a superficie sólida Distribución entre fluido supercrítico y superficie enlazada COLUMNA
    • 20. El proceso cromatográfico Fase estacionaria Fase móvil Muestra (A+B) A B B B Detector ● ● ● ● ● A B ● ● t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 Señal analítica A B Tiempo, min t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 24
    • 21. Parámetros fundamentales Respuesta del detector Tiempo Inyección CH4 Octano No identificado Nonano tr´ = tr - tm tr =tiempo de retención o el que transcurre desde el momento de la inyección de la muestra hasta la aparición de la máxima concentración del compuesto eluido en el detector tm= tiempo muerto o cuando un compuesto no sufre ninguna interacción con la fase estacionaria. tr´ = tiempo de retención corregido o la interacción del soluto con la fase estacionaria 25
    • 22. Aplicaciones de la cromatografía ANÁLISIS CUALITATIVO Señal analítica Disolución estándar CH4 Octano Nonano Decano Tiempo Señal analítica CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano? Tiempo Muestra La muestra no contiene metano ni octano. Si los contiene será a concentraciones inferiores a los correspondientes límites de detección Identificación positiva: - Comparación de datos de retención - Uso de detectores en línea 26
    • 23. ANÁLISIS CUANTITATIVO •La cromatografía cuantitativa en 27 Señal analítica Altura, h Área t Tiempo r tm MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO A. Calibración con patrones: 0 5 10 15 20 25 30 Concentración, ng ml-1 Área de pico, s 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Preparación de disoluciones patrón Obtención de sus cromatogramas columna se basa en la comparación de la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más estándares •Equipos modernos: integración del área
    • 24. Método consiste en introducir en cada disolución estándar, así como en la muestra, una cantidad exactamente medida de una sustancia estándar, a la que se llama patrón interno. La relación entre las áreas (o alturas) del analito y del estándar interno, es el parámetro que representado frente a la concentración de analito, origina una línea recta, cuya ecuación permite calcular la concentración de analito en la muestra.
    • 25. 29
    • 26. Cromatografía de gases
    • 27. 32 Cromatógrafo de Gases
    • 28. 33 Principales componentes ☯Gas de acarreo ☯Controladores de flujo ☯Inyectores ☯Columnas ☯Detectores ☯Sistema de datos
    • 29. Gas de acarreo  Portador o fase móvil, es el que transporta a los compuestos a través de la columna.  Químicamente inerte, puro (> 99%), seco Se aconseja colocar un filtro de carbón activo y una trampa para humedad antes de la entrada del gas al instrumento.  El tipo de gas acarreador depende de la velocidad requerida para el análisis y el tipo de detector a emplear.  Los más utilizados son helio, nitrógeno, hidrógeno o una mezcla argón con 5 % de metano.
    • 30. Inyectores En el puerto de inyección se lleva a cabo la introducción de la muestra
    • 31. Columnas ☛Es donde ocurre la separación y es el “corazón” de un cromatógrafo. ☛Columnas empacadas de: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio ó teflón. ☛Columnas capilares de sílice fundida recubiertas con poliimida. ☛El empaque puede ser un sólido, un líquido o un sólido recubierto por un líquido.
    • 32. Columnas cromatográficas empacadas Se construyen con tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio. Los diámetros interiores van de 1,6 a 9 mm. La longitud suele ser inferior a los 3 m. Se rellenan de un material adsorbente adecuado a las sustancias que se quiere separar.
    • 33. Columnas cromatográficas capilares Se construyen con sílice fundida. Los diámetros interiores suelen ser de 200-250 mm. La longitud suele ser superior a los 20 m. Hay dos tipos: Empacadas con partículas sólidas ocupando el total del diámetro de la columna (micro-empacadas) Tubulares abiertas, con trayectoria para el flujo abierta y sin restricción por el centro de la columna
    • 34. Ejemplos de fases estacionarias en cromatografía de gases Separaciones por punto de ebullición de compuestos en un intervalo amplio de masas moleculares: Escualano Polidimetilsiloxano Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos polidifenildimetilsiloxano policarboranometilcianoetilsilicón Para compuestos nitrogenados poliamida policianoetilmetilsilicon Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos polietilenglicol pentaeritritol tetracianoetilado
    • 35. HORNO • Las columnas cromatográficas se enrollan, se sujetan en un soporte y se introducen en el interior de un horno • El horno debe poderse calentar y enfriar rápidamente • La temperatura se debe poder programar para poder trabajar en régimen de gradiente • Muchas aplicaciones y métodos cromatográficos requieren comenzar a temperaturas por debajo de la ambiental
    • 36. Detector de Ionización a la Llama (FID) Consiste de una llama de hidrógeno-aire y una placa colectora. El efluente de la columna pasa a través de la llama, que ioniza las moléculas orgánicas. Los iones se recogen en un electrodo de polarización negativa y producen una señal eléctrica. El FID es extremadamente sensible y es el detector más ampliamente utilizado, su desventaja es que destruye la muestra.
    • 37. Detector de Espectrometría de Masas, MSD *El espectrómetro de masas usa la relación masa-carga (m/z) de moléculas ionizadas. *Es una técnica muy poderosa que permite cuantificar, identificar y da información acerca de la estructura de compuestos desconocidos.
    • 38. Detector-analizador de masas *La operación general del espectrómetro de masas es: a) crea iones en fase gaseosa b) separa los iones en base a su relación (m/z). c) mide la cantidad de iones de cada relación (m/z). Una vez ionizadas las moléculas, estas pasan al analizador de iones el cual los transporta hacia el detector: Existen diferentes tipos de analizadores los que son utilizados de acuerdo a las necesidades. Dentro de los analizadores podemos citar, la trampa de iones, el sector magnético, el tiempo de vuelo, el cuadrupolo, etc.
    • 39. El cuadrupolo consiste de cuatro cilindros metálicos paralelos, en donde dos de ellos tienen un potencial (U + Vcos(wt)) y los otros dos –(U + Vcos(wt)), lo que le da un rango de frecuencia, los iones con cierta relación (m/z), pasan a través del cuadrupolo, los que no son eliminados. En este sistema se necesita un alto vacío, para el transporte de los iones a través del analizador (10-9 torr).
    • 40. El HPLC (High Performance Liquid Chromatography) o CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) es el método más moderno para realización de cromatografías. La cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases.
    • 41. Diferencias. Fase Móvil Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa. Si es un líquido: Cromatografía líquida. •Cromatografía en capa delgada •Cromatografía líquida en columna abierta •HPLC
    • 42. Sistema HPLC HPLC Solvent Reservoirs Rheodyne Injector HPLC Column 9010 Solvent Delivery System 9050 Variable UV/Vis Detector 9060 Polychrom (Diode Array) Detector Computer Workstation
    • 43. 51 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (PARTES DE UN HPLC) Desgasificador de disolventes Abastecimiento de disolvente Filtro Bomba de alta presión Válvula de seguridad y purga Espacio térmico Columna analítica Lectura Amplificador Recolección o descarga Descarga Gases disueltos Jeringa o válvula para la muestra Introducción de la Preco- muestra lumna Medidor de presión
    • 44. %A %B %C Flow Rate Pressure {H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.) Varian 9010 Solvent Delivery System through pulse dampener Rheodyne Injector Column Ternary Pump from solvent reservoir to detector through pump to column to injector
    • 45. UV Spectrum Chromatogram Varian 9060 Polychrom Detector Reset Ready UV Spectrum {shows full UV abs.} UVmax UVmax Chromatogram {shows peaks, Rt} ABS. Time ABS. Wavelength Rt Rt
    • 46. HPLC Chromatograms 0 1 2 3 4 5 6 7 Time (minutes) Rt = 3.0 min. faster moving less retained Rt = 5.2 min. slower moving more retained Absorbance  Approximation of peak area by triangulation Area = base x height 2 base height Peak A Peak B
    • 47. Chromatography Stationary Phases O O O | | | OSiOSiOSiOH | | | O O O | | | OSiOSiOSiOH | | | O O O bulk (SiO2)x surface relatively polar surface Derivatized Silica Gel relatively nonpolar surface Silica Gel O O O | | | OSiOSiOSiOR | | | O O O | | | OSiOSiOSiOR | | | O O O bulk (SiO2)x surface Where R = C18H37 hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv. silica or “C18”) “normal phase” “reversed phase”
    • 48. Hay dos tipos de fases estacionarias: Fase Normal: el componente principal de la fase estacionaria es muy polar(ej. silice) y la fase móvil es poco o medianamente polar. Bajo estas condiciones los compuestos poco polares eluyen primero Fase Reversa: La fase estacionaria es poco polar, normalmente silica tratada (siloxano) con R de C8H17 (C-8 o n-octil) a C18H37 carbonos (C-18 o n-octildecil). La fase móvil es polar y en estas condiciones los compuestos menos polares son mas retenidos, eluyendo primero los más polares junto con la fase móvil
    • 49. 57 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección (hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de masas o plasmas..etc) La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o fácilmente volatilizables. El resto de muestras que no poseen esas características pueden ser analizadas por HPLC. Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades que ofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten abordar análisis de multicomponentes en muestras de diversa procedencia, con elevada precisión y sensibilidad (dependiendo del detector).
    • 50. EJEMPLO CG 58
    • 51. AgradecimientoS Senescyt (ecuador) a través del proyecto prometeo Universidad técnica de machala: institución de vinculación
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